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蛋白印迹成功指南


蛋白印迹技术是阐释生物过程和疾病背后复杂信号事件的强有力工具。本文重点阐述了蛋白印迹操作流程中的关键步骤,并操作流程变化对您最终印迹结果的影响。
  简介
  蛋白印迹也称作免疫印迹,是一种被广泛应用并得到公认的技术,用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合,测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。抗体也可检测蛋白质的特异性翻译后修饰(PTM)。磷酸化特异性抗体已用于确定特定信号通路组分以及研究在不同生物学背景下磷酸化事件的变化。 最近研发出了针对其他 PTM 的特异性抗体。这使得研究人员可以监控蛋白质乙酰化、甲基化或泛素化状态的变化。
  Cell Signaling Technology(CST)的科学家每天进行一千多次免疫印迹实验以验证我们现有和新的抗体。过去十多年我们一直对免疫印迹操作流程进行优化,您可以参阅第13页,也可以在线阅读(见下面链接)。这样您可以重复这一过程并得到可重复且可靠的结果。
  在此,我们将重点讲述蛋白印迹操作流程中的关键步骤,并展示操作流程变化对您最终印迹结果的影响。我们还将讨论在您的免疫印迹试验中使用经严格验证抗体的重要性。最后,我们将提供CST科学家常用且最适用于与抗体配套使用的试剂清单。

 

  经严格验证抗体的重要性
  一抗是影响数据质量的关键试剂。质量较差的一抗可对实验结果造成干扰,导致结果无法解释或存在误解。要确保抗体对待检测靶标具有特异性,则应验证抗体特异性。验证抗体特异性时,只在预期分子量位置观察到条带是不够的。抗体应经历严格的验证过程。采用若干不同的方法确保抗体能准确检测靶标。
  抗体验证包括:
  在已报道证实蛋白表达的细胞和组织提取物中进行特异性检测,而不仅仅是在重组蛋白中。
  通过使用siRNA转染或敲除细胞系进行特异性确认。
  用诱导或抑制靶标蛋白表达的生长因子、化学活化剂、或抑制剂处理细胞系,直接进行翻译后修饰的抗体特异性检测。
  通过磷酸酶处理.对磷酸化抗体进行磷酸化特异性检测。

   所推荐操作流程中的关键步骤—
  
这些步骤非常重要
  操作步骤的变化可对免疫印迹结果产生显著影晌。我们对裂解产物制备、凝胶、转移、膜、缓冲液、封闭以及抗体稀释和孵育等操作流程步辍的常见差异进行了测试,并找出得到理想结果的方法。您将在后面几页见到一些数据,这些数据用于确定我们推荐的免疫印迹操作流程中的关键步骤。

  推荐的 CST 试剂
  Cell  Signaling  Technology  提供多种标准缓冲液、分子量标记物、蛋白酶和磷酸酶抑制剂、二抗、检测试剂和实验对照供选择,为您的免疫印迹实验提供支持。我们公司内部也使用这些试剂进行免疫印迹抗体验证,因此这些试剂与我们的一抗配套使用良好。

  CST 生产的试剂

 

  技术支持
  我们希望本手册能为您在自己实验室进行免疫印迹试验提供有益的帮助。Cell  Signaling Technology 对为您提供卓越的客户服务和支持而深感自豪,我们也乐于与您分享我们的经验。 我们的所有抗体均在公司内部生产,开发并评估这些试剂的科学家也可以同时为客户提供技术支持服务。可以直接联系这些科学家, 他们会亲自给您提供技术帮助。

  联系方式
  美国
  工作时间:周一至周五早上8:30至晚上8:00[东部标准时间]
  订货电话:877-616-2355 | orders@cellsignal.com
  技术支持:877-678-8324 | support@cellsignal.com
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