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RnD 老司机聊 ELISA

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是最基础的免疫学实验之一,相信很多科研狗都有过使用 ELISA 的经历。

ELISA 操作简单,不需要特殊仪器,一台酶标仪即可完成检测。看似简单,实则不然。ELISA 是个非常严谨、极考验操作者技巧和经验的实验,检测结果没有读值、高 CV 值、高背景等诸多问题也是兵家常事。


Bio-Techne 资深技术支持将在今后的文章中为各位看官列举了一系列 ELISA 常见问题以及解决方法。


查原因:为何样本没有读值

科研最悲催的结果莫过于,辛辛苦苦干一年,读板回到解放前。样本孔没有读值或读值极低是 ELISA 最常见的问题。其关键在于判断是 ELISA 试剂盒的问题,还是样本中目标蛋白表达量低。

·Step 1:分析标准曲线的读值、标准曲线 R2 值、背景值高低等,例如,即使标准曲线最高值只有 1.2,但 R2 值为 0.999,这样的标准曲线同样可用;

·Step 2:如果标准曲线正常,则可以排除 ELISA 试剂盒的品质问题,此时需考虑样本中目标蛋白的表达含量,从笔者多年技术支持经验来看,样本中目标蛋白表达量低是没有读值最常见的原因。

例如,热门炎症因子 IL-6,其正常表达量极低,在 R&D Systems® Quantikine® IL-6(货号:D6050)说明书第 10 页,SAMPLE VALUES 一章中有如下描述:

Serum/Plasma - Forty serum and plasma samples from apparently healthy volunteers were evaluated for the presence of human IL-6 in this assay. Thirty-three samples measured less than the lowest standard, 3.13 pg/mL. Seven samples measured between 3.13 and 12.5 pg/mL. No medical histories were available for the donors used in this study。

由此可见,很多健康成年人的血清/血浆中 IL-6 的表达量显著低于 Quantikine®IL-6 的检测限(标准曲线范围:Sensitivity0.7 pg/mL;Assay Range3.1~300 pg/mL)。

插播一条小知识:

免疫学检测中 Sensitivity 和 Assay Range 的区别:

Sensitivity 指的是免疫检测产品的分析灵敏度,是基于零浓度基础上,区分从无到有的分辨能力;标准曲线检测(Assay Range)下限,即功能灵敏度,基于低浓度的基础上,区分从有到无的分析能力。

说人话就是分析灵敏度主要是用于定性的,即当检测的值低于标准曲线检测下限,高于 Sensitivity 时,提示样本中有目标检测分子,但是具体浓度不确定;当检测的值是在 Assay Range 范围内时,才是定性并且定量的。

从标准曲线的示意图来看,样本读值都落在平台期(下图绿色圆点)不如落到标准曲线中段(下图红线之间区域)准确,所以实验中,不是简单的判断是否有读值,还要确定读值是否准确。

 

ELISA 的 OD 值低于标准曲线最低值时,我们的报告中可标注「ND,non detectable」,或 <(标曲最低值)。

 

早预防:三招提前规避风险

对于样本没有读值的问题,如何提前做足功课防患于未然呢?资深技术支持给你支招:

第一招预估检测蛋白的表达水平

通常来说,炎症因子正常情况下不表达,或是表达量极低,趋化因子表达量较高。所以提前查询天然表达量极为重要,查询方法有多种。

R&D Systems® 的 Quantikine® ELISA 的说明书,会在 SAMPLE VALUES 部分描述血清、血浆、细胞培养上清的天然表达量。以 Quantikine® IL-6(货号:D6050)为例,其中详尽地描述了在未刺激及刺激条件下,细胞培养上清中 IL-6 的表达量:

同时,也可以通过查询相关文献来获得不同模型、不同实验条件下炎症因子的表达量。然而不同实验条件,对于检测的结果也会有差异,所以文献结果仅供参考。

分析 SDF-1 及炎症因子的表达量[1]

此外,还可使用现有的第三方数据库来进行查询,比如梅奥医学中心(Mayo clinic),该网站会对大量临床相关的免疫因子做正常人群的检测,同样以 IL-6 为例,可见正常表达量低于 1.8 pg/mL,这是样本没有读值的主要原因。

面对这种情况,首先评估检测样本是否进行过造模刺激。若样本未经过刺激,且需要检测 IL-6 这种低表达的因子,则应选择高敏的试剂盒。


例如 Human IL-6 Quantikine HS ELISA Kit(货号:HS600C),Sensitivity:0.09 pg/mL,Assay Range:0.2 - 10 pg/mL。也可以在检测时设置阳性对照,可自行使用 PHA 刺激细胞后收集上清,或是购买对应的质控品 Human IL-6 Controls (optional,R&D Systems®Catalog # QC01-1)。

对于样品值范围很宽的样本检测 [AZ1] ,可选择 R&D Systems® 的 QuantiGlo® ELISA 试剂盒,通过鲁米诺化学发光检测原理,检测范围为 10-1104 pg /mL。

第二招样本的巧妙处理

免疫学检测样本的保存和处理非常关键,保存不当容易导致检测蛋白降解。当我们获得样本后,需要进行离心 1,000 x g 10 min,及时分装冻存于 ≤ -20 °C 条件下,并避免反复冻融。还需避免样本出现溶血、污染等问题,若发现样本中有大量絮状沉淀,应通过离心等方法尽力去除,以免影响检测结果的准确性。

对于炎症因子检测:在前期实验条件摸索过程中,可进行多个时间点采样检测,因为炎症因子在体内表达的半衰期不同,同时间点采样,有可能出现炎症因子表达丰度下降而无法检测。

此外,血浆样本抗凝剂的使用也需慎重:使用不当也有可能产生假阳性或假阴性。比如血浆中的肝素可能会吸附某些细胞因子,导致低值。在选择试剂盒时,厂家通常会标注进行过独特抗凝剂的验证,比如 Quantikine® IL-6(货号:D6050)就可以用于检测 EDTA、肝素以及柠檬酸盐抗凝剂处理过的血浆样本。

第三招挑选合适的试剂盒

工欲善其事必先利其器,选择合适的 ELISA 试剂盒是实验成功的关键。

不同的 ELISA 试剂盒,在前期研发时会验证用不同的样本类型,如 Quantikine® IL-6(货号:D6050),验证的样本类型有细胞培养上清、血清、EDTA 血浆、肝素抗凝血浆和柠檬酸盐血浆。

若您购买的 ELISA 试剂盒说明书上没有验证过特定的样本类型,就不能使用吗?不一定,前人栽树后人乘凉,文献中可能已经验证过。在你自行验证时,就有了很大胜算。

这里教大家一个快速查找相关文献的小妙招:作为 ELISA 金标准的 Quantikine® 系列,是经过了无数种属和样本类型考验的。以 Quantikine® IL-6(货号:D6050)为例,当在 R&D Systems® 官网上搜索货号 D6050 后,可以在「Citations」部分找到大量的最新发表文献:

当你检测的样本类型在所选试剂盒未经验证时,则需要自行实验验证,主要是通过线性稀释实验和掺入回收实验来完成,至于这两个实验如何操作,请听下回分解。

参考文献:

Kristocheck M, et al. The homing of bone marrow stem cells is differentially activated in ischemic and valvular heart diseases and influenced by beta-blockers. J Transl Med. 2018 May 21;16(1):133.

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